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乙酰唑胺對胸膜腫瘤小鼠水通道蛋白1的影響研究

【】2016-07-07 點擊次數
基金項目:廣州市衛生局醫藥衛生科技項目(編號:20131A010001)
劉宗師 張靖軒 楊 智:廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院 廣東廣州 510180
通訊作者:張靖軒

乙酰唑胺對胸膜腫瘤小鼠水通道蛋白1的影響研究


劉宗師 張靖軒 楊 智
EFFECT OF ACETAZOLAMIDE ON AQUAPORIN 1 IN MICE WITH PLEURAL TUMOR
LIU Zongshi, ZHANG Jingxuan,YANG Zhi


  【摘 要】 目的 探討乙酰唑胺對胸膜腫瘤小鼠AQP1表達及胸腔積液的影響。方法 建立胸膜腫瘤動物模型,隨機分為腫瘤組和干預組,干預組每日一次經口灌注乙酰唑胺(40 mg·kg-1·d-1)。比較各組小鼠胸腔積液的量,采用熒光定量PCR和免疫組化的方法測定水通道蛋白1及其mRNA的表達。結果 胸膜腫瘤小鼠胸腔內見血性積液及腫瘤結節生長,干預組小鼠胸水量較腫瘤組減少,免疫組織化學染色顯示AQP1表達于胸膜壁層上皮,干預組小鼠壁層胸膜AQP1水平較腫瘤組降低。結論 乙酰唑胺可以抑制胸膜腫瘤小鼠壁層胸膜AQP1及其mRNA的表達,減少惡性胸腔積液。
  【關鍵詞】 惡性,胸膜腫瘤,乙酰唑胺,水通道蛋白1

  【Abstract】 Objective To investigate the effect of acetazolamide to AQP1 and malignant plural effusion in mice with malignant pleuroma. Methods Pleural tumor animal models are built and mice were assigned into pleuroma group(Group A)and intervention group(Group B). Mice in Group B were fed with acetazolamide (40 mg·kg-1·d-1) daily. Plural effusion of mice in these two groups were compared. The levels of AQP1 and AQP1-mRNA were measured by immunohistochemistry and Real-Time PCR. Results The hemorrhagic effusion and tumor nodules in mice of group A and B, and the volume of MPE in group B decreased compared with that of group A, so did the expression of AQP1. Conclusion Acetazolamide can inhibit the generation of AQP1 and its mRNA′s expression and reduce the volume of malignant pleural effusion.
     【Key words】  Malignancy, Pleural tumor, Acetazolamide, Aquaporin 1
     【Author′s address】 Guangzhou first people′s hospital, Guangzhou, Guangdong, 510180, PRC
  doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2015.11.011 

  近年來,呼吸系統腫瘤在全球范圍內的罹患率上升很快[1-2],這與居住環境及個人某些不良嗜好密切相關[3-5],胸膜惡性腫瘤在其中所占的比例相對較低。但因其早期即累及胸膜,呼吸窘迫癥狀的發生早而迅速,患者很早即出現限制性通氣障礙,生活質量極差,且其預后較差,因而,深入研究胸膜惡性腫瘤及惡性胸腔積液的發生、發展機制,有助于治療疾病并改善患者生存質量。而在胸水的發生發展中,水通道蛋白起到很重要的作用[6-8]。肺部主要分布的水通道蛋白亞群為水通道蛋白 1(AQP1),它與胸膜腔液體轉運、腫瘤的發生、發展有一定的關系[9]。乙酰唑胺作為一個經典的藥物,與AQP1與肺癌有著密切的關系,項陽及Ferlay J [10-11]等證實,在肺癌組織內,AQP1的表達明顯增強,應用乙酰唑胺可以部分抑制肺部腫瘤的發展,腫瘤轉移抑制率達到83.9%。這一研究,使人們對乙酰唑胺這一經典藥物有了新的認識,拓寬、加深了乙酰唑胺的可能使用范圍,同時,也使人們從新的角度來重新認識、理解其藥理作用機制。為進一步揭示在胸膜腫瘤的發生、發展過程中,乙酰唑胺與AQP1的變化。在本研究中,我們在腫瘤小鼠中使用乙酰唑胺,觀察其壁層胸膜AQP1表達及惡性胸腔積液量的變化,希望能初步揭示三者之間的內在聯系,期望從分子生物學角度為胸膜惡性腫瘤的治療提供新思路和途徑。
     1 研究分組及實驗方法 
1.1 實驗動物來源
     采用 C57BL/6J 品系小鼠,中山大學實驗動物中心提供,鼠齡 6~8 w,質量20~25 g,性別隨機,動物合格證號:SCXK[粵]2013-0124,動物批號:NO.0026037,實驗前1 w進行環境適應性飼養;Lewis Lung Cancer 細胞(LLC 細胞)來自廣州市第一人民醫院中心實驗室;乙酰唑胺片來自于燕京藥業有限公司。
1.2 儀器與實驗材料
     Eppendorf核酸-微量蛋白測定儀;ABI熒光定量 PCR 儀;Hettich低溫離心機;遠大科技免疫組化系統;辣根過氧化物酶標記的抗兔 Envision多聚物;電泳儀;Hyclone胎牛血清;Tissue-Tek全自動脫水機;DNA合成儀;兔抗鼠 AQP1多克隆抗體; 紫外分光光度計(日立公司);Eppendorf PCR 儀;DAB試劑盒等。
1.3 小鼠分組
     腫瘤組(Group A)、乙酰唑胺干預組(Group B)及對照組(Group C),其中腫瘤組分為6、8、10 d三個亞組,每組7只,分別于注射腫瘤細胞6、8、10 d后處死;乙酰唑胺干預組同樣分為1、8、10 d三個亞組,每組7只,注射腫瘤細胞的次日開始喂服乙酰唑胺(40 mg·kg-1·d-1,ig),胸膜腔內注入LLC細胞后,分別于6、8、10 d取標本;設立正常對照。 
1.4 建造動物模型
     復蘇LLC細胞,進行培養,之后加入PBS將細胞濃度調至1×106。乙醚吸入麻醉小鼠,固定并暴露右胸壁,消毒后用注射器吸取細胞懸液005 mL,于小鼠右側腋前線斜向上進針,對照組注入生理鹽水。解剖發現白色腫瘤結節及血性胸水即為建模成功。 
1.5 收集標本
     將小鼠采用過量麻醉的方法處死,固定并剖開胸腔,觀察胸膜腔腫瘤情況,記錄胸水量。分離胸膜壁層,立即置于超低溫冰箱及多聚甲醛液體。 
1.6 檢測標本
1.6.1 檢測胸膜壁層水通道蛋白1 壁層胸膜經甲醛固定、脫水后,按照免疫組化的操作規程直至修復抗原,按次序加入一抗、二抗,進行DAB顯色,染色并封存,對照組的一抗使用PBS。水通道蛋白1陽性顯色為亮棕色,表達水平與顏色深度呈正相關,圖像分析使用免疫組化測量系統,最終得到的結果是蛋白平均灰度(D)。 
1.6.2 AQP1 mRNA表達 采用R-T PCR法,100 mg胸膜標本中放入Trizol 酶1 mL,徹底進行勻漿,Trizol法提取RNA,經水浴、低溫離心、加異丙醇等過程,得到RNA標本。2 μL RNA樣品,于500 μL DEPC 中稀釋,于A(260)和A(280)處比色,RNA濃度=A(260)×40 μg/mL×250=10 μg/μL。采用 Primer express設計引物,序列如下:M-AQP1(92 bp)Forward Primer:5’-CTACACTGGCTGCGGTATCAAC-3’,Reverse Primer:5’-GCCCCACCCAGAAAATCC-3’;內參序列:M-GAPDH (73 bp) Forward Primer:5’-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3 Reverse Primer:5’-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3’。使用逆轉錄試劑盒(Invitrogen),引物為Oligo(dT)18,取 2 μg總RNA,加DEPC水至總體積12 μL。逆轉錄過程依照試劑盒操作指引進行,產物置于-20 ℃冰箱保存。委托達安基因公司合成引物,進行R-T PCR,50 μL反應體系中含 5×SYBR Green ⅠPCR Buffer 10 μL,上游引物 F 1 μL(濃度10 pmol/μL),下游引物R 1 μL(濃度10 pmol/μL),三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)1 μL,Taq 酶1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O 35 μL。進行40個循環的擴增,條件:93 ℃、3 min,然后 93 ℃、30 s,55 ℃、45 s,72 ℃、45 s,每個循環的第2個步驟收集熒光信號。10倍梯度稀釋cDNA后進行 PCR 擴增檢測擴增效率以樣品拷貝數的對數為橫坐標,Ct 值為縱坐標,最終計算結果為A值,按下列公式換算:A = B1(目的基因)÷B2(內參基因)。其中B=拷貝數/cDNA濃度。 
1.7 統計方法
     使用SPSS 110軟件統計分析數據,計量資料用(±s)表示,組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=005。
2 結果 
2.1 各組胸腔大體情況
     正常對照組小鼠胸膜腔內壁呈粉紅色,表面平滑,無胸水產生。腫瘤組及乙酰唑胺干預組解剖胸腔后,可于右側胸膜腔見血性胸水,其中35例發現白色腫瘤結節(見圖 1)。采集胸膜壁層制作石蠟切片,進行HE 染色,鏡下可見胸膜內有腫瘤細胞浸潤,癌細胞分布錯亂(見圖 2);對照組未見腫瘤結節,內壁平滑。表1結果顯示:隨著胸膜腫瘤的發展,胸水量逐漸由6 d時的(040±002)mL增加至10 d時的(072±002)mL,在同一時間點,B組胸水量較A組減少(P<005)。

 

表1 各組小鼠不同時間點胸水量比較

(±s,mL)

組別 n 6 d 8 d 10 d
A組 21(7×3) 0.40± 0.02 0.61±0.01 0.72±0.02
B組 21(7×3) 0.26±0.011) 0.39±0.041) 0.60±0.031)
C組 21(7×3) 0 0 0
 注:與腫瘤組比較,1)P<0.05
2.2 各組壁層胸膜 AQP1水平
     壁層胸膜間皮細胞內見水通道蛋白1表達,腫瘤組平均灰度值較對照組升高。不同時間的對照組小鼠,AQP1平均灰度的差異無統計學意義(P>0.05),腫瘤組小鼠 AQP1平均灰度值由6 d時的(0.47±0.01)升高至10 d時的(0.69±0.06)(P<0.001),使用乙酰唑胺后,胸膜AQP1的灰度較同時間點的腫瘤組降低(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 胸膜壁層水通道蛋白1水平比較

(±s)

組別 n 6 d 8 d 10 d
A組 21(7×3) 0.47±0.011) 0.53±0.031) 0.69±0.061)
B組 21(7×3) 0.35±0.022) 0.43±0.042) 0.60±0.012)
C組 21(7×3) 0.21± 0.03 0.24±0.02 0.23±0.05
 注:與正常對照組比較,1)P<0.01;與腫瘤組比較, 2)P<0.05

 

圖3 A組小鼠胸膜免疫組化染色
2.3 AQP1mRNA表達
     胸膜惡性腫瘤組小鼠比對照組表達升高(P<0.05),乙酰唑胺干預組小鼠 AQP1 mRNA表達較同一時間點的腫瘤組降低,差異有統計學意義 (P<0.01)。見表3。

表3 各組壁層胸膜 AQP1 mRNA 表達比較

(±s)

組別 n 6 d 8 d 10 d
A組 21(7×3) 3.03±0.111) 4.72±0.241) 6.17±0.331)
B組 21(7×3) 2.17±0.032) 3.53±0.322) 5.19±0.612)
C組 21(7×3) 1.29±0.31 1.20±0.26 1.30±0.25
 注:與正常對照組比較,1)P<0.05; 與腫瘤組比較,2)P<0.01
3 討論
     在呼吸系統腫瘤中,胸膜惡性腫瘤發生率相對較低,但預后極差,早期即可導致大量胸水的產生,嚴重影響患者的生存質量,因而,對其機制進行深入的研究、探討極有必要。但因為其發生率較低,臨床病例收集困難,因此,本研究采用了動物實驗的方法,建立小鼠的胸膜腫瘤模型進行研究。 
     既往已有學者發現,肺部腫瘤發生后,受侵犯部位的通透性會增加,若累及到胸膜,會導致惡性胸腔積液的發生,這已被YANO S等[12]證實。雖然腫瘤組織水液通透性增加的具體機制尚未完全明了,但近年來的一些實驗結果顯示,水通道蛋白在肺部的水液轉運中起重要作用[13],已經有學者證實,AQP1與惡性胸腔積液及某些腫瘤關系較為密切[14-15],一些研究者發現,通過抑制水通道蛋白的作用,可以減緩某些呼吸系統惡性腫瘤的發展[16]。因此,在本研究中,建立胸膜惡性腫瘤的模型后,使用乙酰唑胺抑制AQP1的作用,觀察胸水量及AQP1的變化,最終發現:隨著病情的進展,AQP1表達及胸水量進行性上升。而使用乙酰唑胺進行干預后, 胸水量、AQP1及其mRNA的水平明顯降低。 
     通過這一研究,可以發現,使用乙酰唑胺可以抑制惡性胸腔積液的產生,降低胸膜腫瘤小鼠AQP1的表達水平,結合之前的研究結果可以推測:胸膜惡性腫瘤的發生、發展,與AQP1密切相關,而通過抑制AQP1的表達,有望減緩胸膜惡性腫瘤的進展。希望通過此次的基礎研究,能更好地揭示胸膜惡性腫瘤發生發展的分子生物學機制,為將來的臨床診治奠定一定基礎。

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